Глава 4. Экспериментальный ревматоидный артрит

Предыдыщая страница  |  Следующая страница

На протяжении многих лет проводятся настойчивые попытки воспроизведения РА у животных с целью максимального приближения модели к заболеванию у человека. Известно более 30 способов моделирования РА с введением различных адъювантов и антигенов. Вместе с тем, все существующие модели имеют те или иные недостатки и пока нет полного соответствия по морфологическим признакам патологическому процессу, наблюдаемому у людей. В этой связи дальнейшее изучение данного вопроса представляется весьма актуальным. Естественными моделями РА, которые используются при экспериментальных исследованиях, являются крысы линии Sprague-Dawley, линейные мыши MRL/lpr, MRL/MpJ, MRL/Mp-lpr/lpr, BALB/c, C3H/HeJ и др. Следует подчеркнуть, что существуют определенные клинико-морфологические особенности поражения суставов у самцов и самок с моделями РА.

Суставы.

Нами разработаны несколько способов моделирования РА на крысах линии Wistar. Первый из них основан на пятикратном введения в корень хвоста (по 5 мг/кг массы животного) полного адъюванта Фрейнда с раствором селезеночной ДНК крупного рогатого скота. Дозу второго и трьетьего введения адъюванта уменьшали в вдвое по сравнению с первой, а дозу четвертого и пятого введения снижали еще вдвое по сравнению с предыдущей. Спустя 1,5 месяца от начала эксперимента в условиях наркоза крыс выводили из эксперимента. Второй способ дополняли периодически повторяемыми введениями в желудок через специальный зонд азатиоприна (50 мг/кг) и метилурацила (200 мг/кг), а в полость суставов – полного адъюванта Фрейнда (1,5 мг/кг) и ДНК (1,5 мг/кг).

Ткани суставов, предназначенные для морфологического исследования, фиксировали в 10% растворе забуферного формалина (рН=7,0) в течение 24 часов. Перед фиксацией скакательных суставов удаляли окружающие ткани (кожу, мышцы, связки), кости отсекали на расстоянии 5 мм от метафизарной пластинки, суставную капсулу в одном месте вскрывали, чтобы обеспечить поступление в полость сустава фиксирующей жидкости. После этого суставы помещали в декальцинирующую жидкость на основе этилендиаминтетрауксусной кислоты. Процесс декальцинации выполняли в течение 10 дней при t°=37°C. Далее кусочки ткани обезвоживали и заливали в парафин при температуре не более 60°С на заливочной станции «Leica-EG1140-H/C». Срезы тканей изготовляли толщиной ~5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим (при рН=2,5 и рН=5,3), сафранином и стойким зеленым, по ва-Гизону и Вейгерту, ставили PAS-реакцию. Иммуногистохимическим методом исследовали маркер пролиферации клеток PCNA. Использовали первичные антитела к PCNA, клон PC10, система визуализации «LSAB2-Rat», оптимизированная для крыс, краситель «DAB-DAKO».

Крысиную эмбриональную печень, после инкубации в растворе антибиотиков в течение 120 минут, мы поэтапно подвергали механической и ферментативной дезагрегации (0,25% раствор трипсина на протяжении 15 минут), клеточную суспензию сепарировали на градиенте плотности с целью получения фракции гемопоэтических клеток. Содержание целевых клеток в суспензии определяли методом иммуномаркирования с использованием моноклональных антител на антиген CD34+ с использованием изотоп-контроля. Ткань надпочечников крысиных эмбрионов готовили также. Полученные суспензии целевых клеток хранили в криосреде с 15% диметилсульфоксидом в жидком азоте до непосредственного использования. Клетки вводили однократно интраперитонеально в количестве 2 млн. на одно животное.

При макроскопическом исследовании суставов у крыс с экспериментальным РА, отмечается увеличение скакательных суставов в объеме, ограничение их подвижности, отечность окружающих тканей. При пальпации сочленений на их боковых поверхностях (уровень диафиза костей) обнаруживаются четкообразные уплотнения тканей. Артикулярную полость не вскрывали для сохранения анатомического единства сустава. При микроскопическом исследовании суставов у всех животных выявляются признаки воспаления: дистрофические изменения в хряще, его истончение и образование эрозий на поверхности, наличие серозного и фибринозного экссудата в суставной полости, клеточная инфильтрация синовиальной оболочки, пролиферация синовиоцитов, хондроцитов субсиновиального слоя с развитием гиперплазии ворсин, разрастание грануляционной ткани с разрушением хряща и кости. Для объективизации степени морфологических изменений разработана методика полуколичественной активности патологического процесса в суставах {табл. 4.1}.

Таблица 4.1. Критерии оценки активности воспалительного процесса в суставах крыс с экспериментальным адъювантным артритом

Критерий

Баллы

Оценка

Дистрофические изменения в хряще

0

Отсутствуют

1

Имеются

Наличие фибрина в экссудате

0

Отсутствует

1

Имеется

Толщина неминерализованного хряща

0

Отсутствие изменений

1

Истончение

2

Отсутствие хряща

Пролиферация синовиоцитов

0

Отсутствует

1

Очаговая

2

Диффузная

Пролиферация хрящевой ткани

0

Отсутствует

1

Имеется

2

Образование узелков

Разрастание грануляционной ткани

0

Отсутствует

1

Имеется с разрушением хряща

2

Имеется с проникновением в костно-мозговые полости

3

Имеется с субтотальным разрушением диафиза кости

Пролиферация в подсиновиальном слое

0

Отсутствует

1

Имеется с формированием ворсин

 

Дистрофические изменения в хряще проявляются в виде очаговой дезорганизации основного вещества, возникновения в нем очагов разрежения, расслоения и образования эрозий на суставной поверхности. Один из характерных признаков высокой интенсивности экссудативных процессов при артрите, связанных с резким повышением проницаемости сосудов вследствие их иммунокомплексного повреждения, является появление фибрина в артикулярной полости. Толщину неминерализованного хряща мы оценивали на тех участках суставных поверхностей, которые соприкасались друг с другом во вермя движения. Уменьшение толщины неминерализованного хряща или нарушение его послойного строения проявляется отсутствием расположения клеток среднего слоя в виде перпендикулярных к поверхногсти колонок и/или отсутствием уплощенных хондроцитов в поверхностном слое {рис. 4.1}.

 

4.1

4.2

4.3

 

Выраженность пролиферации синовиоцитов оценивали по толщине их слоя, а нормой считали формирование клетками не более двух слоев. Очаговое утолщение слоя синовиоцитов чаще всего наблюдалось в основании и на вершине образующихся ворсин {рис. 4.2}. Пролиферацию клеток суставного хряща оценивали на препаратах, окрашенных иммуногистохимическим методом с использованием антител к маркеру пролиферации PCNA. В норме окраска наблюдалась в единичных клетках и минерализованном и в нижних слоях неминерализованного хряща. Пролиферация в поверхностном и среднем слоях  приводила к утолщению хряща на участках, которые не контактировали с другим хоящом, т.е. по периферии от суставной поверхности. В некоторых случаях наблюдали пролиферацию хондроцитов с разрушением подлежащей кости или с формированием узелковых разрастаний {рис. 4.3}.

Одним из главных признаков смоделированного артрита было разрастание грануляционной ткани с разрушением суставного хряща и подлежащей кости, что наблюдалось на участках, покрытых синовиальной оболочкой или в местах прикрепления связок. Разрушение хряща и проникновение грануляционной ткани в костно-мозговую полость представлено на рис. 4.4, субтотальное разрушение диафиза кости – на рис. 4.5, а пролиферация в субсиновиальном слое с гиперплазией синовии и формированием ворсин – на рис. 4.6. В поздние сроки моделирования РА происходило уменьшение интенсивности экссудативно-деструктивных процессов в сторону процессов пролиферации в различных структурных компонентов сустава. При этом появляются очаги пролиферации хрящевой ткани, увеличение объема и глубины проникновения в костно-хрящевые структуры новообразованной грануляционной ткани.

 

4.4

4.5

4.6

 

В группе крыс, леченных лефлуномидом, пролиферация синовиоцитов по своей интенсивности аналогична таковой у животных без лечения в ранние сроки и в 1,6 раза меньше, чем в группе с поздними сроками моделирования артрита. Во всех наблюдениях после применения лефлуномида пролиферация хрящевой ткани отсутствовала, в 1,5 раза уменьшалась интенсивность пролиферации в субсиновиальном слое, в 3,0 раза уменьшалась выраженность дистрофических изменений хряща, в 1,3 меньшим было повреждение неминерализованного хряща в виде его истончения или исчезновения. В группе животных, которым вводили стволовые клетки, интенсивность пролиферации синовиоцитов находилась на том же уровне, что и в раннем сроке артрита без лечения. Обращала на себя внимание наибольшая по выраженности пролиферация хрящевой ткани, которая в 1,5 раза превышала параметры у крыс без лечения. Интенсивность разрастания грануляционной ткани после введения стволовых клеток увеличивалась вдвое, но была в 3,6 раза меньше, чем в позние сроки без лечения. Ни в одном из наблюдений не зарегистрированы пролиферация в субсиновиальном слое и наличие фибрина в экссудате. При лечении крыс циклофосфамидом отмечена максимальная интенсивность пролиферации синовитов, хотя не наблюдалось пролиферации хрящевой ткани. Интенсивность разрастания грануляционной ткани, пролиферации в субсиновиальном слое и изменений толщины слоя неминерализованного хряща на фоне циклофосфамидной терапии были идентичны таковым у животных, получавших лефлуномид. После введения крысам с адъювантным артритом клеток надпочечников интенсивность пролиферации синовиоцитов возрастала, однако пролиферация хондроцитов становится в 2,1 раза меньшей. При этом максимальным из всех групп животных было разрастание ткани (в 6,1 раза выше, чем у нелеченных крыс).

Нами было проведено исследование состояния гормонального фона у крыс с адъювантным артритом на фоне различных вариантов лечения У нелеченных животных наблюдается снижение в 3,8 раза уровня тиреотропного гормона (ТТГ) в крови на фоне повышенного содержания тироксина, его свободной фракции и трийодтиронина. В группах трансплантации стволовых клеток и клеток надпочечников сохранялось снижение концентрации ТТГ соответственно в 3 раза и на 33%, что сопровождалось повышением в этих группах тироксина, свободного тироксина и трийодтиронина. Аналогичные изменения отмечены в группах животных с артритом, получавших лечение БПРП лефлуномидом (см. главу 15). Наиболее приближающимися к норме оказались гормональные показатели при лечении ГКГ дексаметазоном и цитотоксическим антагонистом фолиевой кислоты метотрексатом (глава 15). Существенной динамики уровня кортикостерона в крови у крыс без лечения и у получавших лефлуномид и цитостатики (метотрексат, алкилант циклофосфамид) не было. Лишь введение дексаметазона приводило к угнетению синтеза кортикостерона на 13%. По прошествии 14 дней эксперимента наблюдалось парадоксальное уменьшение содержания кортикостеронемии в процессе введения клеток надпочечников. Кстати, также вело себя лечение животных эмбриональными стволовыми клетками.

Наиболее высокая активность оксидантной системы нами установлена в крови крыс с адъювантным артритом, которые не получали никакого лечения при одновременном снижении параметров антиоксидантной защиты {рис. 4.7}. Так, если у интактных крыс параметры продукта ПОЛ МД в среднем составили 2,49 мкмоль/л, то у животных, получавших дексаметазон – 2,70 мкмоль/л, клетки надпочечников – 3,05 мкмоль/л, стволовые клетки – 3,06 мкмоль/л, циклофосфамид – 3,08 мкмоль/л, метотрексат – 3,32 мкмоль/л, лефлуномид – 3,34 мкмоль/л, а у нелеченных животных с дебютом артрита показатели составили 3,86 мкмоль/л, у нелеченных особей на отдаленных этапах обследования – 3,95 мкмоль/л. В свою очередь, значения антиоксиданта церуллоплазмина в крови этих группах крыс соответственно составили 460 мг/л, 269 мг/л, 271 мг/л, 276 мг/л, 326 мг/л, 398 мг/л, 442 мг/л, 194 мг/л и 247 мг/л.

Пролиферация синовиоцитов пораженных суставов играет ключевую роль в развитии ревматоидного паннуса и разрушения артикулярных поверхностей костей. Активность клеточной пролиферации тесно связана с метаболизмом ДНК, интенсивность биосинтеза которой зависит от сбалансированности фонда предшественников – дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Непосредственно в сборке молекул ДНК используется тимидинтрифосфат, предшественником которого является тимидинмонофосфат (тимидилат). Наиболее интенсивно синтез тимидилата в пролиферирующих тканях суставов происходит по запасному пути. Существуют два изофермента тимидинфосфорилазы – анаболический (ТФА) и катаболический (ТФК), соотношение активности которых и определяет активность синтеза тимидилата.

Рис. 4.7. Различия показателей ПОЛ у животных с экспериментальным артритом разных групп по сравнению с параметрами у интактных крыс, которые приняты за 100%.

1 – дексаметазон, 2 – клетки надпочечников, 3 – стволовые клетки, 4 – циклофосфамид, 5 – метотрексат, 6 – лефлуномид, 7 – ранний нелеченный артрит, 8 – поздний нелеченный артрит.

По нашим данным, наиболее выраженное угнетение активности ТФК наблюдается в крови нелеченных животных, соответственно в ранние (на 43%) и поздние (на 71%) сроки артрита (соответственно 21,8 нмоль/мин´мл и 10,9 нмоль/мин´мл). Введение циклофосфамида, аллогенных эмбриональных стволовых клеток и клеток надпочечников {рис. 4.8} не приводит к существенному увеличению активности ТФК. Наибольшее увеличение активности этого фермента наблюдается у крыс на фоне лечения лефлуномидом (на 68%; 63,8 нмоль/мин´мл) и дексаметазоном (на 22%; 46,3 нмоль/мин´мл). 

Предыдыщая страница  |  Следующая страница

Другие страницы

Страница 2 Страница 3 Страница 4 Литература