Трансплантация клеток костного мозга

Предыдыщая страница  |  Следующая страница

Наряду с трансплантацией отдельных органов – почек, сердца, печени, легких и др. – в современной медицине успешно применяется пересадка различных тканей, в частности, клеток костного мозга. В сложной структуре последнего наиболее изучены две основные популяции составляющих его недифференцированных стволовых клеток – гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – общие предшественники мезенхимальных производных. В норме стволовые клетки костного мозга обеспечивают структурное замещение погибших дифференцированных клеток. Как известно, все дифференцированные клетки в организме человека, участвующие в выполнении органоспецифических функций, имеют ограниченный срок жизни. Поддержание клеточного и структурного гомеостаза происходит как за счет деления дифференцированных клеток с образованием идентичных по гено- и фенотипу потомков, так и путем замещения отмирающих дифференцированных клеток потомками недифференцированных ранних предшественников – стволовых клеток.

Трансплантация ГСК получила широкое распространение сначала в онкогематологии, а затем при лечении тяжелых форм различных аутоиммунных заболеваний, в том числе РА (проводится трансплантация в основном аутологичных ГСК). К 2002 году в мире была проведена трансплантация стволовых аутологичных клеток 500 таким больным, причем в случаях рефрактерного РА пересадка ГСК выполняется с 1996 года. Активное применение метода связано с обнадеживающими первыми результатами. Ремиссии без поддерживающего лечения достигается с частотой до 30% от числа больных.

Применение стволовых клеток костного мозга продолжает активно изучаться и обсуждаться. Применение МСК началось позже, чем ГСК, и опыт их использования значительно меньше. Впервые МСК были применены вместе с ГСК, и с этого времени интерес к ним только возрастает в связи с распознанными потенциальными иммуномодулирующими, противовоспалительными и тканепротективными свойствами. Существуют два подхода к трансплантации стволовых клеток в артрологии: 1) тканевой (пересадка перихондрального/периостного, хрящевого или костно-хрящевого материала); 2) клеточный (трансплантация хондроцитов, перихондральных/периостных или МСК).

Еще в 1987 году впервые была проведена замена артикулярных тканей с помощью трансплантации аутологичных хондроцитов, выращенных ex vivo. В процессе отдаленного наблюдения получены следующие результаты: 1) в случаях одиночного поражения бедренного мыщелка отмечается высокая частота хороших и отличных результатов (85-90%), а при другой локализации поражений аналогичные результаты не превышают 75%; 2) среди пациентов с вовлечением в патологический процесс надколенника и бедренного мыщелка результаты расценены как удовлетворительные 80-85% случаев.

Стволовые клетки обладают способностью к самообновлению, т.е. поддержанию собственной популяции. При воздействии определенных сигналов стволовые клетки костного мозга могут подвергаться асимметричному делению, в результате которого образуются не только МСК, но и МСК-прогениторы, впоследствии подвергающиеся дифференцировке в клетки соответствующего фенотипа. МСК и МСК-прогениторы контролируют пролиферацию, дифференцировку и скорость апоптоза стволовых клеток, находящихся в паренхиме органов и необходимых для защиты тканей от повреждений. Эти клетки также обладают способностью к цитопротекции и иммуносупрессии, что дает им возможность активно участвовать в поддержании иммунологического гомеостаза.

Постнатальный костный мозг содержит 1-5´106 мультипотентных МСК, что составляет около 10% от общего количества его клеток. По своему составу стромальная популяция МСК представляет собой гетерогенную группу клеток-предшественников (или прогениторных клеток), обладающих рядом общих фенотипических маркеров и функциональных свойств, позволяющих классифицировать их как МСК. МСК присущ ряд интересных свойств, отражающих их уникальность и предполагающих заманчивые перспективы использования для лечения широкого круга заболеваний.

Важнейшее свойство МСК – мультипотентность, которая заключается в способности дифференцироваться в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение, т.е. три основные линии клеток: остеоциты, адипоциты и хондроциты. Поэтому МСК иногда называют «скелетными» стволовыми клетками. В соответствующих условиях in vitro МСК дифференцируются и в другие негемопоэтические клетки эктодермального и эндодермального фенотипа: миоциты, тендиноциты, лигаментоциты, кардиомиоциты, нейрональные клетки и др. Дифференцировочный потенциал МСК в значительной степени зависит от микроокружения. В костном мозге МСК функционируют в динамичной системе, включающей дифференцированные фибробласты, ретикулярные клетки эндотелия, компоненты экстрацеллюлярного матрикса и регуляторные цитокины. Составляющие систему клетки взаимодействуют между собой и с другими клетками через специфические рецепторы и молекулы адгезии.

Специфического маркера у МСК нет, но фенотип характеризуется носительством определенных поверхностных клеточных маркеров – CD73+, CD90+, CD105+, CD166+, а также отсутствием маркеров гемопоэтических клеток (CD45-, CD14-, CD11-b, CD116-, CD34, CD11-a, CD19-, CD79-). МСК не распознаются иммунной системой и тормозят иммунный ответ. Мезенхимальные клетки не экспрессируют HLA-DR-маркеры и избегают контролирующего влияния иммунной системы, т.е. обладают свойством иммунологической привилегированности. Считается, что при пересадке МСК иммунотолерантность со стороны иммунной системы реципиента не обусловлена отсутствием (или низкой степенью экспрессии) молекул большого комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности МСК. Были обнаружены высокая степень экспрессии антигенов MHC I класса и отсутствие антигенов MHC II класса, которые обнаруживались внутриклеточно, а после добавления в культуру g-интерферона MHC II класса экспрессировались и на клеточной поверхности МСК. Известно, что в отсутствие костимулирующих молекул контакт Т-клеточного рецептора и MHC приводит к состоянию анергии Т-лимфоцитов. Поэтому, МСК не распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами и естественными киллерными (NK) клетками и способны выживать в аллогенном окружении. Поскольку МСК неиммуногенны, их введение не сопровождается реакцией отторжения, поэтому аллогенные МСК могут быть трансплантированы при HLA-несовместимости донора и реципиента без необходимости иммуносупрессии. Эти уникальные иммунные свойства МСК делают их идеальными для использования в клеточной терапии.

МСК модулируют функции большой клеточной популяции иммунных клеток, включающей цитотоксические Т-лимфоциты, NK, В-лимфоциты, дендритные клетки и др. Иммуномодулирующие свойства МСК реализуют посредством различных механизмов, в первую очередь секретируя соответствующие различные растворимые факторы, и через клеточно-контактное взаимодействие с клетками-мишенями. Среди важнейших растворимых факторов МСК, оказывающих иммуномодулирующее действие на клетки иммунной системы – трансформирующий фактор роста, фактор роста гепатоцитов, PgЕ2, IL10, индоламин-2,3-диоксигеназа, NO и др.

МСК подавляют Т-клеточную пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов, индуцированную митогенами, аллогенами или CD28 антителами, а в комбинации с провоспалительными цитокинами (g-интерферон, TNFa, IL1b и др.) оказывают супрессивное действие как на врожденный, так и на приобретенный иммунитет. МСК не распознаются аутореактивными Т-клетками in vitro. По-видимому, эти качества МСК способствуют пролонгации выживаемости аллотрансплантатов и могут уменьшать выраженность реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), когда трансплантируются вместе с гемопоэтическими клетками костного мозга.

Антипролиферативные и иммуномодулирующие свойства представляют большой интерес для клинического применения. Будучи активированными сигналами воспалительного микроокружения, МСК способны комплексно влиять на клетки иммунной системы посредством контактных и гуморальных механизмов, приводя к блокированию клеточного цикла и снижению клеточной реактивности, а также стимулируя ауторегуляторную функцию лейкоцитов. Существует способность МСК инициировать различные паракринные события, приводящие к защите тканей от повреждения. Некоторые из этих эффектов осуществляются через растворимые факторы, такие как трансформирующий фактор роста β. Показана также способность МСК к репрограммированию целевых клеток через межклеточные контакты. При системном введении МСК активно перемещаются в воспаленные и/или поврежденные ткани («хоуминг») посредством специфических рецепторов хоуминга. Ведущим механизмом действия стволовых клеток является паракринная (гуморальная) активация покоящихся локальных тканевых стволовых клеток, и лишь в малой степени имеет место прямая дифференцировка в клеточные элементы поврежденных тканей.

Масса поврежденных в результате РА клеток зачастую так велика, что вводимых стволовых клеток недостаточно для замены даже части пострадавших тканей. Число погибших синовиоцитов может достигать огромных количеств, поэтому вводимое число стволовых клеток не может быть достаточным для прямой их дифференцировки в синовиоциты. Поэтому восстановление популяции дифференцированных клеток реализуется при участии регионарных стволовых, прогениторных и мигрирующих клеток иммунной системы при обязательном условии сохранения межклеточных взаимодействий, определяемых цитокинами, хемокинами, ростовыми факторами, белковыми молекулами межклеточного матрикса. Любые стволовые клетки, и МСК в частности, способны синтезировать целый «коктейль» цитокинов, включая противовоспалительные, и факторов роста, обладающих трофическими свойствами. Например, клетки пуповинной крови синтезируют целый набор нейротрофических факторов: нейротрофический фактор мозга, глиальный нейротрофический фактор, фактор роста нервов, несколько нейротрофинов. При введении стволовых клеток наблюдается выброс множества биологически активных веществ, способных проникать в поврежденные ткани и оказывать эффекты, направленные на восстановление их структуры и функции.

Точные механизмы участия МСК в гомеостазе и репарации нормальных тканей полностью не расшифрованы. Полагают, что МСК принимают участие в воспалительном процессе, возможно, в фазе рассасывания повреждения. Происхождение МСК, обнаруживаемых в тканях, окончательно не установлено. Один из потенциальных источников тканевых МСК – это перициты, высвобождающиеся из кровеносных сосудов в процессе повреждения последних. Часть МСК может оказаться в тканях в результате эпидермально-мезенхимальной трансформации, а часть МСК мигрирует в ткани непосредственно из костного мозга. Показана важная роль МСК в процессе заживления кожных повреждений. МСК присутствуют в коже на всех стадиях репарации, после эпителизации раны их количество постепенно увеличивается, достигая максимума в процессе тканевого ремоделирования. На культуре МСК доказано образование этими клетками ростостимулирующих факторов и цитокинов (IL10, трансформирующий фактор роста b, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор – ГКСФ), в то же время существуют указания на возможность пролиферации и трансдифференцировки этих клеток в зоне повреждения в сосудистые эндотелиальные клетки и фибробласты, секретирующие коллаген I и III типа. Это сопровождается образованием хорошо васкуляризованной грануляционной ткани, богатой коллагеном I типа, привлечением в рану воспалительных клеток под влиянием синтезируемых IL6, IL8 и ГКСФ с инициацией процесса восстановления кожи. Эти данные открыли перспективы применения МСК при различных заболеваниях с целью тканевой регенерации.

Типичная черта МСК – способность прилипать к пластиковой поверхности лабораторной посуды, поэтому их достаточно легко выделить из любого источника. Поскольку МСК не имеют специфического поверхностного маркера, их выявляют по главной характеристике – способности к трилинейной дифференцировке. Основные источники МСК для исследовательских целей – костный мозг, жировая ткань и сосуды пуповины. Следует подчеркнуть, что выделенные из любого источника МСК представляют собой гетерогенную популяцию, клетки которой обладают различным дифференцировочным и пролиферативным потенциалом. Популяция МСК неоднородна по своему составу даже в пределах одной ткани, имеются также некоторые особенности МСК, полученных из разных источников, например профили синтезируемых биологически активных субстанций.

МСК из костного мозга обладают разным потенциалом к дифференцировке: 30% дифференцируются в три линии клеток, упомянутых выше, а 70% – только в две (остеокласты и хондроциты) или даже одну (остеоциты). Стромальные клетки, полученные из жировой ткани, отличаются выраженным ангиогенным потенциалом благодаря трансдифференцировке в клетки эндотелиального фенотипа, а также высокой активностью близкодействующих (паракринных) молекулярных взаимодействий. В ситуации ишемии эти клетки могут уменьшать размер рубцовой ткани благодаря антифиброзному эффекту и проявляют клеточно-протективный эффект против таких повреждений, как окислительный стресс и апоптоз. МСК полученные из плаценты оказывают стимулирующее воздействие на синтез в клетках основных белков, в частности эластина и коллагена, которые являются строительным материалом и основой внутриклеточного матрикса и стимулируют образование и рост сосудов микроциркуляторного русла.

Клетки пуповинной крови применяются как альтернатива клеткам костного мозга. Пуповинная кровь содержит смесь различных мультипотентных стволовых клеток, способных дифференцироваться в клетки эндодермального, мезодермального и эктодермального зародышевых листков. Клетки пуповинной крови отличаются очень высокой способностью к пролиферации и дифференцировке. Система их успешного применения хорошо отработана, а технология получения концентрата клеток из пуповинной крови проста, причем хранится концентрат в жидком азоте неограниченно долго. Отработаны методы оценки клеточного состава образцов, накоплен опыт их сбора и хранения, работает система сертифицированных криобанков. Концентрат клеток пуповинной крови применяют без дополнительного культивирования, что гарантирует отсутствие инфицирования образца и возможности возникновения мутаций в процессе культивирования.

Известно, что при патологических состояниях после системного введения в кровоток МСК мигрируют преимущественно в лимфоидные органы, поврежденные и воспаленные ткани, где контактируют с активированными иммунными клетками и модулируют их функции. Полагают, что МСК играют роль в поддержании периферической толерантности и поэтому рассматривается возможность их применения в клеточной терапии для подавления реакций отторжения трансплантата, для защиты органных трансплантатов от отторжения и для коррекции аутоиммунных нарушений.

Опыт лечения с помощью МСК РА пока скромен и касается описания отдельных случаев или небольших исследований. На настоящем этапе МСК при РА были применены преимущественно у рефрактерных к традиционной терапии больных с плохим прогнозом. Показано, что при лечении таких пациентов происходят снижение активности, улучшение серологических маркеров и стабилизация почечной функции без серьезных побочных эффектов. Имеются описания успешного лечения с помощью однократной инфузии МСК из аллогенных клеток костного мозга. Однократную инфузию аллогенных МСК пупочного канатика применяли с хорошим и серьезных побочных действий от лечения не отмечено.

Мировая литература посвящена научному обоснованию и разработкам методов использования МСК при заболеваниях костей и суставов, в частности при РА, с целью восстановления необратимо поврежденных тканей. Несмотря на огромную экспериментальную базу, качественные клинические испытания пока не проводились, имеются лишь отдельные сообщения. Так, проводится лечение МСК, при котором клетки накладываются на хрящевые дефекты в коленных суставах в специальных фиксирующих подложках. Через 42 нед у больных РА, получивших МСК, тканевая регенерация суставных тканей существенно лучше, чем в контрольной группе пациентов, не получивших терапии МСК. Однократное введение аутологичных стволовых клеток интраартикулярно женщинам, которым планировалось протезирование коленного сустава, привело к существенному уменьшению болей и улучшению функции в первые 6 мес после инъекции. В последующие полгода было отмечено некоторое уменьшение эффекта. По данным МРТ, проведенной через год после инъекции, отмечается увеличение толщины хряща и уменьшение зон субхондрального отека у каждого второго больного. Наиболее перспективный метод тканевой инженерии суставного хряща – совместное культивирование суставных хондроцитов и МСК. Ппоказано, что МСК стимулируют хондрогенез благодаря трофическому эффекту, значительно повышая хондрогенный потенциал суставных хондроцитов. Кроме того, такой метод позволяет решить проблему недостаточного количества аутологичных первичных суставных хондроцитов.

Аллогенные МСК применены для лечения тяжелого рефрактерного РА у 4 больных. Через 1 и 6 мес после однократного системного введения МСК у трех из них снизились боль, оцениваемая по визуальной аналоговой шкале, и индекс DAS28, а у двух больных через 6 мес отмечен удовлетворительный эффект по критериям EULAR (у этих пациентов, имевших эффект от введения МСК, развилось обострение РА через 7 и 23 месяца). Никаких серьезных побочных эффектов не наблюдается и при хорошей переносимости эффективность терапии МСК остается предметом дискуссий. Подводить итоги клинических испытаний эффекта МСК при РА преждевременно. Имеющиеся данные трудно интерпретировать, поскольку в исследования включались неоднородные группы больных, до и после трансплантации они получали разное лечение, применялись нестандартизованные оценки исходов. В целом, механизм действия МСК дает основание для оптимизма.

Предметом особого внимания является безопасность клеточной терапии. В первую очередь это относится к возможности злокачественного перерождения трансплантируемых клеток. В экспериментах на мышах было отмечено, что при культивации уже на ранних пассажах стволовые клетки могут подвергаться злокачественной трансформации, а при длительном культивировании этот феномен возникает закономерно. Важно подчеркнуть, что при культивации стволовые клетки оказываются в условиях, близких, но отнюдь не идентичных, физиологическим. Они извлечены из своего естественного микроокружения и лишены его ингибирующих и регулирующих сигналов. Происходят генетические аберрации, в результате которых клетка может приобрести туморогенные характеристики. Трансплантация МСК человека, подвергшихся недолгой (до 10 пассажей) культивации, безопасна, так как даже при длительной культивации они стабильно сохраняют свои основные характеристики. В частности, показано, что при длительном (до 25 пассажей) культивировании в МСК человека, выделенных из костного мозга здоровых доноров, не происходит хромосомных аберраций, клетки сохраняют стабильный кариотип in vitro. Безопасность лечения с применением МСК проверяется во многих клинических испытаниях и было показано, что переносимость терапии ими очень хорошая, а побочные реакции редки. 

Предыдыщая страница  |  Следующая страница