Глава 13. Ревматоидный артрит и система оксида азота

Предыдыщая страница  |  Следующая страница

Еще три десятиления назад оксид азота (окись азота, NO) был известен главным образом как токсичный газ в атмосфере городов и рассматривался с точки зрения проблем экологии. Последующие исследования в области физиологии, патофизиологии, биохимии и иммунологии убедительно показали, что NO в организме обладает широким спектром биорегуляторного действия, а функции NO «простираются от регуляции кровяного давления до антимикробной защиты и внутриклеточной сигнальной трасдукции». Сейчас трудно назвать функцию организма, в регуляции которой NO не принимал бы участия.

В 1980 году впервые представлены данные, что вазодилататорный эффект ацетилхолина зависит от целостности сосудистого эндотелия. Была высказана гипотеза, согласно которой эндотелиоциты продуцируют какую-то субстанцию, названную «эндотелиальным расслабляющим фактором». Спустя 7 лет этот фактор был идентифицирован как NO. Необходимо подчеркнуть, что Нобелевская премия 1998 года в области физиологии и медицины была присуждена Р.Фёрчготту, Л.Игнарро и Ф.Мьюрэду – американским ученым, внесшим значительный вклад в изучение биологической активности NO за открытие «роли оксида азота как сингальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы».

NO является термодинамически нестабильным бесцеветным летучим газом и при повышении температуры до 30°С и атмосферного давления ~200 атм NO трансформируется в N2O и NO2. Термином «оксид азота» обозначается восстановленная форма моноокиси азота (NO), т.е. свободный радикал с полупериодом распада всего от 2 до 30 секунд. Однако эта короткоживущая лабильная молекула может стабилизироваться, что позволяет ей выполнять не только аутокринные, но и паракринные функции. Кроме собственного радикала NO существуют еще две его редокс-формы: нитрозоний-катион (NO—) и нитроксил-анион (NO+).

NO относится к важнейшим биологическим медиаторам в организме больных РА, регулирующим тонус сосудов и гладких мышц внутренних органов, болевую рецепцию и систему иммунитета, обладает антитромботическим и антиагрегационным действием, участвует в пуриновом обмене. К числу стимуляторов синтеза NO относятся ацетилхолин, брадикинин, серотонин, ангиотензин-II, 5-гидрокситриптамин, эрготонин, адениннуклеотиды, субстанция Р, кальциевые ионофоры, тромбин. Наиболее важными физиологическими стимулами для активации NOS (а значит и продукции NO) являются изменения концентрации кислорода и напряжения сдвига, т.е. смещения крови по отношению к эндотелиальным клеткам.

Образующийся при РА NO стимулирует растворимую гуанилатциклазу, что ведет к синтезу cGMP (вторичного посредника для нейромедиаторов и гормонов), вызывающего активацию протеинкиназ и последующие реакции в клетках-мишенях. NO относится к мощным катализаторам образования дисульфидных мостиков и благодаря взаимодействию с SH-группами может определять процессы синтеза белка клетками. CGMP является одним из вторичных мессенджеров системы регуляции тканевого метаболизма. Участиe NO в обмене сводится, фактически, к роли cGMP во внутриклеточных процессах. Этот вывод подтверждается экспериментально: NO и аналоги cGMP оказывают одинаковое воздействие на клеточную жизнедеятельность. Гидролиз cGMP осуществляется под действием фосфодиэстеразы, хотя за накоплением cGMP в клетке ответственна гуанилатциклаза, существующая в двух формах – растворимой и мембраносвязанной. Это не только разные белки, но они и регулируются разными механизмами. Растворимая гуанилатциклаза – гетеродимер, состоящий из двух иммунологически различных субъединиц, а мембраносвязанная форма – трансмембранный фермент, состоящий из одной полипептидной цепи. С биологическими эффектами NO связана растворимая форма фермента.

При РА NO, активируя растворимую гемсодержащую гуанилатциклазу, повышает уровень cGMP, который в присутствии инозитолмонофосфата и фосфорилированного белка фосфоламбана в свою очередь усиливает активность Ca2+-АТФаз, осуществляющих транспорт ионов кальция внутрь эндоплазматического ретикулума. CAMP играет роль эффектора отрицательной обратной связи, а увеличение его содержания в крови больных РА может ингибировать интенсивность окислительно-восстановительных реакций и снижать потребность тканей в кислороде.

NO образуется из аминокислоты L-аргинина путем присоединения молекулярного кислорода к концевому атому азота в гуанидиновой группе (L-аргинин + НАДФН2 +О2 = NO + L-цитруллин) под воздействием различных изоформ NOS (К.1.14.13.39) – стереоспецифических ферментов, обнаруживаемых в эндотелии и миоцитах сосудов, нейронах, лимфоцитах, нейтрофилах, тромбоцитах, макрофагах, фибробластах, тучных клетках, гепатоцитах и других клетках. NOS является одним из наиболее регулируемых энзимов. Уже выявлено несколько его кофакторов и простетических групп: тиолатсвязанный гем, FAD, EMN, кальмодулин, Са, тетрагидро-L-биоптерин и др.. В качестве кофактора для синтеза NO используется НАДФН2. NOS близка по структуре цитохрому Р-450 и имеет места связывания для флавинаденинмононуклеотида и флавинадениндинуклеотида. Активность NOS изменяется под воздействием стресса и гипоксии.

Образование димера NOS осуществляется путем межмолекулярного контакта в области кальмодулинсвязывающего домена. При образовании димерной структуры «голова» одного мономера соединяется с «хвостом» другого. Предполагается, что аргинин и тетрагидробиоптерин связываются в области близкой к терминальному NH2-концу. Тетрагидробиоптерин либо включается в этот процесс непосредственно, либо участвует в аллостерической регуляции NOS. 1,5 моль НАДФН2 используется на образование одной молекулы NO. Флавиновые кофакторы и цитохром Р-450-домен NOS выполняют функцию переносчика электронов от НАДФН2 к молекулярному кислороду (оксидазный домен). Гидроксилированная форма L-аргинина при участии кислорода и гема цитохрома Р-450-домена превращается в L-цитруллин с одновременным образованием NO.

Идентифицированы 3 изоформы NOS, каждая из которых кодируется собственным геном. NOS катализируют окислительно-восстановительную реакцию с участием кислорода и кофакторов (НАДФН2, тетрагидробиоптерина). В неактивном состоянии NOS представляют собой мономеры, содержащие 5 мест связывания для 5 разных кофакторов. Неселективными ингибиторами NOS являются структурные аналоги L-аргинина – L-NG-монометиларгинин, L-NG-аргининметилэфир, L-N6-1-иминоэтиллизин, аминогуанодин.

Под воздействием увеличенного содержания Са в крови больных РА активируется эндотелиальная NOS (eNOS) кальмодулинзависимым механизмом. NO диффундирует в гладкомышечные сосудистые клетки, где связывает гем растворимой гуанилатциклазы, тем самым активируя ее. Продукция cGMP уменьшает содержание клеточного Са, в результате чего происходит релаксация гладких мышц. Кальмодулин при РА регулирует активность nNOS (нейрональной) и eNOS, а в iNOS (индуцибельной или индуцированной) он присутствует в качестве тесно связанной субъединицы. Кальмодулин определяет перенос электронов в NOS в двух точках: на флавины и далее к гемовой части фермента, причем это влияние может быть функционально разделено. В регуляции eNOS участвует белок кавеолин, являющийся антагонистом кальмодулина. Все предполагаемые кальмодулинсвязывающие участки eNOS, nNOS и iNOS попадают под определение канонического кальмодулинсвязывающего района, а регуляция белков, имеющих в своем составе эти районы, зависит от концентрации ионов Са. Пептиды, соответствующие кальмодулинсвязывающему участку iNOS, у больных РА взаимодействуют с кальмодулином независимо от концентрации ионов Са или присутствия хелаторов, приобретая a–спиральную конформацию.

Конститутивная NOS (сNOS) постоянно находится в цитоплазме клеток, зависит от содержания кальмодулина и значительно инактивируется при низких концентрациях свободного Са. При РА NO, образующийся под влиянием cNOS, действует как переносчик физиологических ответов организма. СNOS, выделенные из разных типов клеток, во многом сходны между собой, а антисыворотки против cNOS одних тканей взаимодействуют с другими, но не реагируют с iNOS, что указывает на принципиальное различие этих ферментов.

Функциональная активность iNOS не зависит от поступления ионов Са в клетку (кальций-кальмодулиннезависимая), но активация данного фермента у больных РА сопровождается повышением генной транскрипции. Отметим, что іNOS не присутствует постоянно в клетках и не работает как cNOS, а синтезируется при патологических состояниях, в том числе РА. Сейчас насчитывается более 20 клеток, в которых происходит экспрессия iNOS. Если сNOS является ключевым фактором защиты организма от ишемии, инфекции, усиленного тромбообразования и многих других повреждений, то экспрессия iNOS происходит под влиянием эндотоксинов, цитокинов и прочих факторов, активирующих процессы свободнорадикального окисления.

При активации фермента у больных РА, iNOS способна продуцировать большие количества (наномоли) NO в течение продолжительного времени. INOS активируется под действием бактериальных липополисахаридов, эндотоксинов, ГКГ, эстрогенов, IL1b, g-интерферона, TNFa, трансформирующего фактора роста b. Она образует и обеспечивает длительное выделение NO сосудистым эндотелием, активированными макрофагами, нейтрофилами, микроглиальными клетками, астроцитами. NO в данном случае выполняет функцию неспецифической защиты организма, причем, либо способствуя самостоятельно или совместно с другими высокоактивными свободными радикалами (О2—, ONOO—, OH—) реакции фагоцитоза, либо при определенных условиях (слишком высоких тканевых концентрациях NO) усиливая развитие ревматоидного процесса.

Значительную роль в регулировании содержания NO в тканях больных РА играет гемоглобин, который активно связывает молекулы NO с образованием метгемоглобина и нитратов. NO проникает в капилляры, где вступает в реакцию с гемоглобином эритроцитов и удаляется током крови. Гемоглобин может влиять как на концентрацию NO в крови, так и на продолжительность его жизни. Гемоглобин в дезоксиформе способен восстанавливать NO2 в NO. Кислород может выступать в качестве ингибитора нитритредуктазной активности пигмента крови. Такую же функцию у больных РА осуществляет миоглобин, находящийся в дезоксиформе. Восстановление NO2 в NO осуществляется в митохондриях и микросомах (в первом случае нитритредуктазную функцию выполняет цитохромоксидаза, а во втором – цитохром Р-450). Таким образом, гемсодержащие белки (гемоглобин, миоглобин, цитохромоксидаза и цитохром Р-450), взаимодействуя с кислородом, восстанавливают NO2 в NO и тем самым замыкают цепочку превращений «L-аргинин ® NO ® NO2—/NO3—» в единый цикл NO. На уровне макромолекул (белков) нитритредуктазная активность сопряжена с кислородтранспортной и кислородаккумулирующей функциями соответственно гемоглобина и миоглобина.

С NO реагируют обе формы гемоглобина – мет- и оксигемоглобин. Реакция метгемоглобина с NO обратима и константы скорости прямой и обратной реакций сравнительно невелики. Реакции окси- и дезоксигемоглобина лимитированы только диффузией и практически необратимы, не зависят от структуры белка. Промежуточным комплексом NO в биологических системах является его комплекс с гемоглобином (HbNO), который обнаруживают в плазме при РА. В то же время известно, что эритроцитарный гемоглобин у больных РА реагирует с NO на 2-3 порядка медленнее, чем свободный и в норме эритроциты не экстрагируют NO из плазмы.

NO, который является универсальным регулятором, принимающим участие практически во всех процессах, у больных РА вовлечен в формирование срочной и долговременной адаптации, обладая выраженными защитными свойствами при стрессорных воздействиях. Показано, что донаторы NO при РА могут повышать устойчивость организма к стрессу, а долговременная адаптация к последнему увеличивает продукцию NO в тканях суставов и в других органах. Система NO у таких пациентов может представлять собой одну из стресс-лимитирующих систем.

У больных РА системное повышение уровня стабильных метаболитов NO (нитритов/нитратов) соответствует увеличению кортизола плазмы. Обнаружена прямая связь между повышением содержания NO в синовиоцитах и числом клеток, в которых появляется маркер активности NOS цитруллин и стрессорным высвобождением адренокортикотропного гормона и кортикостерона. Увеличение синтеза NO в синовиальной среде суставов может превратиться из звена адаптации в звено патогенеза и стать не менее опасным повреждающим фактором для организма, чем дефицит NO. Гиперпродукция NO при РА обычно обусловлена экспрессией iNOS под действием эндо- и экзотоксинов, медиаторов воспаления и других факторов, особенно свободнорадикального окисления. Последние активируют ядерный фактор транскрипции kB, который в свою очередь индуцирует синтез iNOS. В повышенный синтез NO вносит вклад и активация cNOS. Избыток NO у больных РА инактивирует железосодержащие белки, в число которых входят дыхательные ферменты митохондрий, и ингибирует рост и размножение клеток. Кроме того, соединяясь со свободными кислородными радикалами, NO образует токсичные пероксинитриты, которые вместе с NO вызывают повреждение ДНК и мутации.

Ограничение гиперпродукции NO в тканях суставов больных РА осуществляется главным образом по принципу отрицательной обратной связи. NO может прямо инактивировать NOS за счет соединения с гемсодержащей группой фермента, подавлять экспрессию гена iNOS путем предупреждения активации фактора транскрипции ядерного фактора kB и ингибирования его связывания с ДНК, а также индукции и стабилизации фактора IkB-a – эндогенного ингибитора нуклеарного фактора kB. Поскольку все виды адаптации оказывают стимулирующее действие на синтез NO в организме, предварительное повышение уровня NO лежит в основе способности адаптации предупреждать гиперпродукцию NO и связанные с ней нарушения. Чрезмерное накопление NO в организме больных РА играет ведущую роль в развитии нарушения тонуса и повреждений сосудов, что приводит к угнетению пролиферации и увеличению частоты апоптоза лимфоцитов и макрофагов, а следовательно, возникновению вторичных иммунодефицитов.

NO, являясь свободным радикалом, способен участвовать в цепных свободнорадикальных реакциях, в ходе которых наряду с продолжением и обрывом цепей могут осуществляться и элементарные реакции размножения активных центров. Одним из наиболее ярких доказательств реальности цепных механизмов при РА считается обнаружение цепной природы реакций полимеризации, при которых о происхождении цепи можно судить по молекуле полимера. Переход белков из растворимого в мембранно-связанное состояние у больных РА является следствием полимеризации, возникающей благодаря инициации NO реакцией с так называемыми «разветвленными цепями», которые имеют большое значение для метаболической активации внутриклеточных процессов, в ходе которой ферменты переходят из менее активного состояния (растворимая форма) в более активное (мембранно-связанная форма).

Физиологические процессы, связанные с NO, при РА осуществляются в результате циклических превращений большого числа нитро- и нитрозосоединений, а также промежуточных веществ. NO обладает широким спектром биологического действия в качестве одного из мессенджеров клеточной сигнализации. NO рассматривается как первый представитель класса молекул, осуществляющих межклеточную коммуникацию и регуляцию множества функций в тканях суставов.

Такая активная форма кислорода, как NO выполняет роль биологического медиатора во многих физиологических процессах, подвергаясь метаболизму одним из трех основных способов: 1) запуск многообразных клеточных эффектов NO при связывании газа с гемсодержащим ферментом гуанилатциклазой, дальнейшая быстрая реакция с гемоглобином эритроцитов, образование метгемоглобина и анионов NO2— и NO3—; 2) образование нитрозотиолов; 3) реакция с супероксиданионом (О2—), которая через пероксинитрит (ОNОО—) приводит к образованию гидроксилрадикала (ОН—); оба этих вещества являются оксидантами, высокоактивными в отношении липидов, белков и нуклеиновых кислот. Именно во время усиленной продукции супероксиданиона у больных РА, NO вступает в реакцию с последним, после чего через синтез токсичного пероксинитрита значительно интенсифицируется ПОЛ и оксидация сульфгидрильных групп. В присутствии пероксинитрита или продуктов его распада образуются радикалы глутатиона, в результате чего последний из антиоксиданта превращается в прооксидант, инициирующий процессы ПОЛ.

Образование пероксинитрита в реакции взаимодействия NO с супероксидрадикалом протекает со скоростью 6,7.109 М—1сек—1, что в три раза превышает скорость реакции СОД с супероксидом. При увеличении продукции NO в суставных тканях его концентрация у больных РА значительно превышает внутриклеточную активность СОД, что ведет к повышению содержания супероксида и соответственно к увеличению образования пероксинитрита. Как сильный окислитель пероксинитрит обладает высокой степенью цитотоксичности, окисляя при РА сульфгидрильные группы цитоплазматических белков, липопротеиды и ДНК.

Свободный радикал NO образуется вследствие восстановления иона нитрита. Эта реакция в полной мере объясняет неоднозначность действия NO2 и NO3. Данную стадию называют регуляторным звеном в цепи метаболических преобразований нитросоединений, который определяет широкий спектр их действия. При наличии кислорода NO окисляется до диоксида – свободнорадикального соединения. Радикалы NO и NO2 могут снова превращаться в ионы нитрита и нитрата, образуя метаболический цикл, включающий промежуточные азотсодержащие вещества, способные в дальнейшем вступать в окислительно-восстановительные процессы. Ион нитрита после, попадания в кровь больных РА, проникает сквозь мембраны эритроцитов и взаимодействует с дезоксигемоглобином, окисляя его в метгемоглобин.

В организме больных РА NO2 могут оказывать свое токсическое влияние практически на всех структурно-функциональных уровнях. Звено превращения ионов нитрита в NO (NO2—®NO) определяет многочисленные токсические свойства NO2: способность ионов окислять гемоглобин и образовывать Hb-NO-комплексы, оказывать влияние на активность растворимой гуанилатциклазы и уровень cGMP и на внутриклеточную концентрацию ионов Са. Через изменение содержания последних осуществляется регуляция метаболизма клеток синовиальной среды суставов многочисленными ферментными системами, а также вторичными мессенджерами. NO, окисляясь в присутствии кислорода до двуокиси азота, может взаимодействовать с белками (SH-группами цистина и цистеина, ОН-группами тирозиновых остатков), а также с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембран клеток и субклеточных структур. Свободнорадикальные продукты (окись и двуокись азота) обладают способностью повреждать белки и ненасыщенные жирные кислоты, уменьшать активность большинства ферментных систем (исключение составляют растворимая гуанилатциклаза и АДФ-рибозилтрансфераза), нарушать целостность клеточных и субклеточных мембранных структур, разобщать окислительное фосфорилирование, ингибировать транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий, понижать уровень аденозинтрифосфорной кислоты в крови и клетках артикулярных тканей, участвовать в образовании R- и Т-конформеров Hb-NO-комплексов. 

Предыдыщая страница  |  Следующая страница

Другие страницы

Страница 2 Страница 3 Литература